冷卻水、冷凝水中嗜肺軍團菌檢驗方法

　　本附錄規定了集中空調通風系統冷卻水、冷凝水及其形成的沉積物、軟泥等樣品中嗜肺軍團菌的檢驗方法。

　　A1原理

　　待測水樣經過濾膜或離心濃縮后，一部分樣品經酸處理與熱處理，以減少雜菌生長，一部分樣品不作處理。將上述處理與未處理樣品分別接種BCYE瓊脂平板并進行培養，生成典型菌落并經生化培養和血清學實驗鑒定確認則判定為嗜肺軍團菌。

　　A2 主要儀器設備

　　A2.1 平皿：90mm

　　A2.2 培養箱：35~37℃

　　A2.3 紫外燈：波長360±2nm

　　A2.4 濾膜濾器

　　A2.5 濾膜：孔徑0.22～0.45μm

　　A2.6 蠕動泵

　　A2.7 離心機

　　A2.8 渦旋振蕩器

　　A2.9 普通光學顯微鏡、熒光顯微鏡、體式鏡

　　A2.10 水浴箱

　　A3 采樣

　　A3.1 采樣容器：可選擇玻璃瓶或聚乙烯瓶，沉積物與軟泥需用廣口瓶，容器均需螺口或磨口，用前滅菌。

　　A3.2 采樣量：每個采樣點依無菌操作取水樣(或沉積物、軟泥等樣品)約200ml。

　　A3.3 中和：經氯或臭氧等消毒的樣品，采樣容器滅菌前加入硫代硫酸鈉溶液以中和樣品中的氧化物。

　　A3.4 樣品運輸與貯存：樣品最好2天內送達實驗室，不必冷凍，但要避光和防止受熱，室溫下貯存不得超過15天。

　　A4 方法與步驟

　　A4.1 樣品處理

　　A4.1.1 沉淀或離心：如有雜質可靜置沉淀或1000r/min離心1min去除。

　　A4.1.2 過濾：將經沉淀或離心的樣品通過孔徑0.22～0.45μm濾膜過濾，取下濾膜置于15ml滅菌水中，充分洗脫，備用。

　　A4.1.3 熱處理：取1ml洗脫樣品置50℃水浴加熱30min。

　　A4.1.4 酸處理：取5ml洗脫樣品，調pH至2.2，輕輕搖勻，放置5min。

　　A4.2 接種與培養：取A4.1.2洗脫樣品、A4.1.3 熱處理樣品及A4.1.4 酸處理樣品各0.1ml，分別接種GVPC平板。將接種平板靜置于CO2培養箱中，溫度為35~37℃，CO2濃度為2.5%。無CO2培養箱可采用燭缸培養法。觀察到有培養物生成時，反轉平板，孵育10天，注意保濕。

　　A4.3 觀察結果：軍團菌生長緩慢，易被其它菌掩蓋，需每天在體式鏡上觀察。軍團菌的菌落顏色多樣，通常呈白色、灰色、藍色或紫色，也能顯深褐色、灰綠色、深紅色;菌落整齊，表面光滑，呈典型毛玻璃狀，在紫外燈下，有熒光。

　　A4.4 菌落驗證：從每一個平皿上挑取2個可疑菌落，接種BCYE和L-半光氨酸缺失的BCYE瓊脂平板，35~37℃培養2天，凡在BCYE瓊脂平板上生長而在L-半光氨酸缺失的BCYE瓊脂平板不生長的則為軍團菌菌落。

　　A4.5嗜肺軍團菌型別的確定：應進行生化培養與血清學實驗確定嗜肺軍團菌。生化培養：氧化酶(-/弱+)，硝酸鹽還原-，尿素酶-，明膠液化+，水解馬尿酸。血清學實驗：用嗜肺軍團菌診斷血清進行分型。

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